研究成果

1 强光对紫苏叶RA积累的影响

为了研究光对紫苏叶RA含量的影响，采用不同的光处理方法，包括白光（WL）、白光+蓝光（WL+BL）、白光+红光（WL+RL） ）、暗色（dark）、弱光（LL）、正常光（GL）和高光（HL）。 HL处理7天后，紫苏叶中RA含量显着增加。在其他光照处理中，RA含量没有显着变化。选取两个不同的紫苏品种作为实验材料。后续研究采用HL治疗1 h和48 h作为治疗条件。

在0和1 h强光处理组中，两个紫苏品种的叶片均表现出健康、平坦的外观。然而，连续暴露在强光下48小时后，两个品种的叶子在胁迫下都明显卷曲（图1A）。采用高效液相色谱法进一步研究了紫苏叶中酚酸的含量。首先，测量RA和CA的水平。强光处理1 h后，RA含量略有增加。值得注意的是，连续强光处理48 h（HL48h）后，两个品种的RA含量均显着积累（图1B）。同样，CA 含量也显示出类似的趋势（图1C）。然后测定总酚酸(TP)含量。强光处理下，两个品种紫苏叶中总磷含量显着增加。 HL48h处理后，两个品种紫苏叶的TP含量分别达到1.59倍和1.88倍。在HL48 组中观察到最高的反应。这些结果表明，强光处理显着诱导紫苏叶中TP（RA和CA）的积累。

图1 不同HL处理下金银花叶片表型及RA含量变化

2. 迷迭香酸生物合成及调控相关上调基因的鉴定

为了研究强光处理期间参与RA 生物合成的关键调控基因，对分别接受强光处理0、1 和48 小时的两个紫苏品种进行转录组测序。皮尔逊相关系数（R）值和主成分分析（PCA）都表明每组内的重复样本之间具有高度相似性。与HL0h相比，HL1h处理后有592个基因上调，而与HL0h和HL1h相比，HL48h处理后有1,060个基因上调（图2A）。 KEGG分析结果显示，592个DEG中大部分基因富集于SMs生物合成相关通路。此外，一些基因显示出与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及苯丙氨酸代谢相关的途径的富集（图2B）。此外，酪氨酸代谢途径中也富集了特定基因（图2C）。 GO富集分析还表明，592个DEG和1,060个DEG可能与HL胁迫下RA的积累过程有关。

此外，在两个紫苏品种中还发现了参与RA合成途径的编码基因，包括PAL、C4H、4CL、RAS、TAT、HPPR和CYP98A。大多数这些基因在强光处理下上调（图2D）。在PF626品种中，更多的RA合酶基因在HL1h组中上调，而在PF68品种中，这些基因主要在HL48h组中上调。尽管对强光胁迫的反应时间存在差异，但两个品种中参与RA 合成途径的基因均存在大幅上调的趋势。但值得注意的是，PF626品种中编码RA合成途径相关基因的基因比PF68品种对强光胁迫更加敏感。

图2 差异表达分析及RA生物合成途径

3. 利用WGCNA分析确定RA生物合成的调控因素

为了阐明与RA 生物合成相关的调控因素，我们使用WGCNA 进行了相关分析。该分析产生了八个不同的基因模块，每个模块都显示出与两种酚酸含量的不同相关性（图3A）。在这些模块中，MEbrown模块与RA具有最大的正相关性，而MEblack模块与CA具有最大的负相关性（图3A）。 MEbrown 模块由1,960 个基因组成，是本研究的重点。这些基因主要富集于与光合作用、触角蛋白合成、叶绿素代谢以及苯丙氨酸和酪氨酸合成相关的途径（图3B）。在该模块中，发现了参与RA 合成的3 个基因（PfTAT1、PfTAT2 和PfC4H）和93 个转录因子。此外，构建的共表达网络显示NAC2、MYB8、TCP1、TCP3、GRAS1、MYB_related1、C3H3和Dof转录因子占据了该模块的中心位置（图3，C和D）。 PfNAC2 作为候选基因中的诱导基因出现（图3E）。 PfNAC2 蛋白具有保守的NAC A-D 结构域，与辣椒中的NAC035 蛋白(XP016538913.1) 同源。此外，PfGBF3蛋白也在592个基因组中上调并被鉴定为DEG（图2A）。 PfGBF3 属于bZIP 转录因子家族，与拟南芥中的BL 信号响应因子AtGBF1（OAP09286.1、OAP09285.1）同源。

此外，转录组分析和RT-qPCR验证证实HL1h组中PfNAC2和PfGBF3基因的表达显着增加。相反，HL48h组中PfTAT1、PfTAT2和PfC4H基因的转录水平显着增加（图3F）。强烈的共表达关系和观察到的诱导表达趋势表明PfNAC2和PfGBF3可能在调节RA生物合成基因PfTAT1、PfTAT2和PfC4H的表达中发挥正向调节作用。

图3 已鉴定的RA 生物合成调节因子

4. PfNAC2 和PfGBF3 对RA 生物合成基因的调节

对PfC4H、PfTAT1 和PfTAT2 启动子序列上游2000 bp 内的顺式作用元件进行了分析。在PfC4H、PfTAT1 和PfTAT2 基因的启动子中发现了三个NAC 和bZIP 转录因子的结合元件，即CACGTG 基序、ABRE 和G-box 顺式元件。酵母单杂交(Y1H) 测定发现PfGBF3 和PfNAC2 促进由PfC4H 启动子驱动的LacZ 表达。此外，还进行了双荧光素酶测定（图4D），证明了它们的相互作用（图4E）。该结果表明PfNAC2和PfGBF3转录因子均可与启动子结合并激活PfC4H基因的表达。

有趣的是，在PfNAC2 基因的启动子序列中也发现了GBF3 转录因子的结合位点G-box (TACGTG) 元件。酵母单杂交实验发现PfGBF3促进了PfNAC2启动子驱动的LacZ的表达（图5B），双荧光素酶实验也验证了这一实验。这些结果表明PfGBF3激活PfNAC2和PfC4H的表达。

图4 PfGBF3和PfNAC2转录因子激活PfC4H的转录

图5 PfGBF3转录因子激活PfNAC2的转录

5.PfNAC2、PfGBF3和PfC4H促进紫苏中RA的合成

为了进一步证实其调控功能，在紫苏植物中进行了农杆菌介导的瞬时表达实验和稳定转化实验。将农杆菌注射到子叶中以进行瞬时基因表达。孵育7天后，测量RA含量。与对照相比，过表达PfNAC2、PfGBF3和PfC4H的植物叶片中RA水平较高（图6A），但TP含量没有显着差异（图6B）。上述结果表明，PfNAC2、PfGBF3和PfC4H均能促进紫苏类植物RA的积累。

随后PfNAC2基因的稳定转化产生了三个携带PfNAC2的转基因品系，并证实PfNAC2成功整合到紫苏基因组中。在表达PfNAC2 的转基因系中没有观察到显着的表型差异（图6C）。然而，三个PfNAC2 系中的RA 含量分别显着增加（图6D）。与对照相比，转基因品系的TP含量也有所增加（图6E）。此外，还鉴定了基因的表达水平。转基因植物中PfNAC2基因的表达量增加了2.32-3.53倍（图6F）。有趣的是，转基因PfNAC2植株中PfGBF3基因分别增加了6.62倍、8.78倍和13.6倍，表明PfNAC2对PfGBF3具有负反馈作用。此外，在转基因PfNAC2 植物中，PfC4H 基因分别上调2.68 倍、3.17 倍和5.11 倍（图6F）。此外，编码C4H的PfC4H2、PfC4H3和PfC4H4在转基因PfNAC2植株中的表达量也上调，这与PfC4H的表达趋势一致。稳定的转基因PfNAC2系不仅能显着刺激RA的积累，而且能显着刺激TP的积累，表明PfNAC2是紫苏叶酚类代谢物生物合成的重要正调节因子。可以认为该调节途径在紫苏叶中诱导PfC4H。表达量增加。

图6 PfNAC2通过农杆菌介导的稳定转基因系统促进RA合成

麦威总结

通过转录组和代谢组联合分析，对两个紫苏品种在强光处理0h、1h和48h下进行分析。 1小时和48小时的强光处理分别导致592个和1,060个基因上调。在这些基因中，共表达了3个结构基因和93个转录因子。值得注意的是，NAC家族成员PfNAC2、GBF家族成员PfGBF3和肉桂酸4-羟化酶基因PfC4H在强光胁迫下表现出显着的共表达和上调。转录激活分析表明PfGBF3 结合并激活PfNAC2 启动子。此外，PfNAC2和PfGBF3均与PfC4H启动子结合，从而正向调节PfC4H的表达。 PfNAC2、PfGBF3 和PfC4H 的瞬时过表达以及PfNAC2 的稳定转基因表达导致紫苏中RA 积累的大幅增加。因此，PfGBF3作为光敏感因子，正向调节PfNAC2和PfC4H，并且PfNAC2在强光胁迫下也调节PfC4H并促进RA积累。阐明紫苏强光条件下RA积累的调控机制，为开发高产RA系统和理解光诱导代谢积累模型奠定了基础。